ຂ່າວ

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) ແມ່ນອະນາລັອກຂອງທາດຍ່ອຍ β-galactosidase, ເຊິ່ງແມ່ນ inducible ສູງ.ພາຍໃຕ້ການ induction ຂອງ IPTG, inducer ສາມາດປະກອບເປັນສະລັບສັບຊ້ອນທີ່ມີທາດໂປຼຕີນ repressor ໄດ້, ດັ່ງນັ້ນການສອດຄ່ອງຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ repressor ມີການປ່ຽນແປງ, ດັ່ງນັ້ນມັນບໍ່ສາມາດຖືກລວມເຂົ້າກັນກັບ gene ເປົ້າຫມາຍ, ແລະ gene ເປົ້າຫມາຍໄດ້ຖືກສະແດງອອກຢ່າງມີປະສິດທິພາບ.ດັ່ງນັ້ນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ IPTG ຄວນຖືກກໍານົດແນວໃດໃນລະຫວ່າງການທົດລອງ?ໃຫຍ່ກວ່າແມ່ນດີກວ່າບໍ?
ທໍາອິດ, ໃຫ້ເຮົາເຂົ້າໃຈຫຼັກການຂອງ IPTG induction: E. coli's lactose operon (ອົງປະກອບ) ມີສາມ genes ໂຄງສ້າງ, Z, Y, ແລະ A, ເຊິ່ງ encode β-galactosidase, permease, ແລະ acetyltransferase, ຕາມລໍາດັບ.lacZ hydrolyzes lactose ເຂົ້າໄປໃນ glucose ແລະ galactose, ຫຼືເຂົ້າໄປໃນ allo-lactose;lacY ອະນຸຍາດໃຫ້ lactose ໃນສະພາບແວດລ້ອມຜ່ານເຍື່ອຈຸລັງແລະເຂົ້າໄປໃນເຊນ;lacA ໂອນກຸ່ມ acetyl ຈາກ acetyl-CoA ກັບ β-galactoside, ເຊິ່ງກ່ຽວຂ້ອງກັບການກໍາຈັດຜົນກະທົບຂອງ Toxic.ນອກຈາກນັ້ນ, ມີລໍາດັບການດໍາເນີນງານ O, ລໍາດັບເລີ່ມຕົ້ນ P ແລະ gene ລະບຽບການ I. ລະຫັດ gene I ແມ່ນທາດໂປຼຕີນຈາກ repressor ທີ່ສາມາດຜູກມັດກັບຕໍາແຫນ່ງ O ຂອງລໍາດັບປະຕິບັດການ, ດັ່ງນັ້ນ operon (meta) ຈະຖືກບີບອັດແລະ ປິດ.ນອກນັ້ນຍັງມີສະຖານທີ່ຜູກມັດສໍາລັບ catabolic gene activator site binding protein-CAP ຢູ່ທາງເທິງຂອງລໍາດັບການລິເລີ່ມ P. ລໍາດັບ P, ລໍາດັບ O ແລະສະຖານທີ່ຜູກມັດ CAP ຮ່ວມກັນປະກອບເປັນພາກພື້ນກົດລະບຽບຂອງ lac operon.genes ການເຂົ້າລະຫັດຂອງສາມ enzymes ຖືກຄວບຄຸມໂດຍພາກພື້ນກົດລະບຽບດຽວກັນເພື່ອບັນລຸການສະແດງອອກທີ່ປະສານງານຂອງຜະລິດຕະພັນ gene.

ໃນກໍລະນີທີ່ບໍ່ມີ lactose, lac operon (meta) ແມ່ນຢູ່ໃນສະພາບຂອງການກົດຂີ່.ໃນເວລານີ້, lac repressor ສະແດງອອກໂດຍລໍາດັບ I ພາຍໃຕ້ການຄວບຄຸມຂອງລໍາດັບໂປໂມຊັ່ນ PI ຜູກມັດກັບລໍາດັບ O, ເຊິ່ງປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ RNA polymerase ຜູກມັດກັບລໍາດັບ P ແລະຂັດຂວາງການເລີ່ມຕົ້ນ transcription;ເມື່ອ lactose ມີຢູ່, lac operon (meta) ສາມາດ induced ໃນລະບົບ operon (meta), inducer ທີ່ແທ້ຈິງບໍ່ແມ່ນ lactose ຕົວຂອງມັນເອງ.Lactose ເຂົ້າໄປໃນຈຸລັງແລະຖືກ catalyzed ໂດຍ β-galactosidase ເພື່ອປ່ຽນເປັນ allolactose.ສຸດທ້າຍ, ເປັນໂມເລກຸນ inducer, ຜູກມັດກັບທາດໂປຼຕີນຈາກ repressor ແລະການປ່ຽນແປງການສອດຄ່ອງຂອງທາດໂປຼຕີນ, ເຊິ່ງນໍາໄປສູ່ການ dissociation ຂອງທາດໂປຼຕີນຈາກ repressor ລໍາດັບ O ແລະ transcription.Isopropylthiogalactoside (IPTG) ມີຜົນກະທົບດຽວກັນກັບ allolactose.ມັນເປັນ inducer ທີ່ມີອໍານາດຫຼາຍ, ເຊິ່ງບໍ່ໄດ້ຖືກ metabolized ໂດຍເຊື້ອແບັກທີເຣັຍແລະມີຄວາມຫມັ້ນຄົງຫຼາຍ, ສະນັ້ນມັນຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນຫ້ອງທົດລອງ.

ວິທີການກໍານົດຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນທີ່ດີທີ່ສຸດຂອງ IPTG?ເອົາ E. coli ເປັນຕົວຢ່າງ.
E. coli BL21 ສາຍພັນທີ່ສ້າງຂຶ້ນຕາມກຳມະພັນທີ່ບັນຈຸ pGEX ບວກ (CGRP/msCT) ຖືກນຳໄປໃສ່ໃນຕົວກາງຂອງແຫຼວ LB ທີ່ບັນຈຸ 50μg·mL-1 Amp, ແລະລ້ຽງລູກໃນຄືນທີ່ 37°C.ວັດທະນະທໍາຂ້າງເທິງໄດ້ຖືກ inoculated ເຂົ້າໄປໃນ 10 ແກ້ວຂອງ 50mL LB ຂອງແຫຼວຂະຫນາດກາງທີ່ມີ 50μg·mL-1 Amp ໃນອັດຕາສ່ວນຂອງ 1:100 ສໍາລັບການຂະຫຍາຍຕົວວັດທະນະທໍາ, ແລະໃນເວລາທີ່ຄ່າ OD600 ແມ່ນ 0.6 ~ 0.8, IPTG ໄດ້ຖືກເພີ່ມເຂົ້າໄປໃນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສຸດທ້າຍ.ມັນແມ່ນ 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.ຫຼັງຈາກ induction ຢູ່ໃນອຸນຫະພູມດຽວກັນແລະເວລາດຽວກັນ, 1 mL ຂອງການແກ້ໄຂເຊື້ອແບັກທີເຣັຍໄດ້ຖືກເອົາມາຈາກມັນ, ແລະຈຸລັງເຊື້ອແບັກທີເຣັຍໄດ້ຖືກເກັບກໍາໂດຍການ centrifugation ແລະຂຶ້ນກັບ SDS-PAGE ເພື່ອວິເຄາະອິດທິພົນຂອງຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ IPTG ທີ່ແຕກຕ່າງກັນກ່ຽວກັບການສະແດງອອກຂອງທາດໂປຼຕີນ, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນ. ເລືອກຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ IPTG ດ້ວຍການສະແດງອອກຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ໃຫຍ່ທີ່ສຸດ.
ຫຼັງຈາກການທົດລອງ, ມັນຈະພົບວ່າຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ IPTG ແມ່ນບໍ່ໃຫຍ່ເທົ່າທີ່ເປັນໄປໄດ້.ນີ້ແມ່ນຍ້ອນວ່າ IPTG ມີຄວາມເປັນພິດທີ່ແນ່ນອນຕໍ່ເຊື້ອແບັກທີເຣັຍ.ເກີນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຍັງຈະຂ້າເຊນ;ແລະໂດຍທົ່ວໄປແລ້ວ, ພວກເຮົາຫວັງວ່າທາດໂປຼຕີນທີ່ລະລາຍຫຼາຍສະແດງອອກໃນເຊນ, ດີກວ່າ, ແຕ່ໃນຫຼາຍໆກໍລະນີເມື່ອຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ IPTG ສູງເກີນໄປ, ຈໍານວນຂະຫນາດໃຫຍ່ຂອງການລວມກັນຈະຖືກສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນ.ຮ່າງກາຍ, ແຕ່ປະລິມານຂອງທາດໂປຼຕີນທີ່ລະລາຍຫຼຸດລົງ.ດັ່ງນັ້ນ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ IPTG ທີ່ເຫມາະສົມທີ່ສຸດມັກຈະບໍ່ໃຫຍ່ກວ່າ, ແຕ່ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຕ່ໍາກວ່າ.
ຈຸດ​ປະ​ສົງ​ຂອງ​ການ​ນໍາ​ໃຊ້​ແລະ​ການ​ປູກ​ຝັງ​ສາຍ​ພັນ​ວິ​ສະ​ວະ​ກໍາ​ພັນ​ທຸ​ກໍາ​ແມ່ນ​ເພື່ອ​ເພີ່ມ​ຜົນ​ຜະ​ລິດ​ຂອງ​ທາດ​ໂປຼ​ຕີນ​ທີ່​ເປົ້າ​ຫມາຍ​ແລະ​ຫຼຸດ​ຜ່ອນ​ຄ່າ​ໃຊ້​ຈ່າຍ​.ການສະແດງອອກຂອງ gene ເປົ້າຫມາຍບໍ່ພຽງແຕ່ໄດ້ຮັບຜົນກະທົບຈາກປັດໃຈຂອງສາຍພັນຂອງຕົນເອງແລະການສະແດງອອກຂອງ plasmid, ແຕ່ຍັງໂດຍເງື່ອນໄຂພາຍນອກອື່ນໆ, ເຊັ່ນ: ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ inducer, ອຸນຫະພູມ induction ແລະເວລາ induction.ດັ່ງນັ້ນ, ໂດຍທົ່ວໄປ, ກ່ອນທີ່ທາດໂປຼຕີນທີ່ບໍ່ຮູ້ຈະສະແດງອອກແລະບໍລິສຸດ, ມັນດີທີ່ສຸດທີ່ຈະສຶກສາເວລາ induction, ອຸນຫະພູມແລະຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ IPTG ເພື່ອເລືອກເງື່ອນໄຂທີ່ເຫມາະສົມແລະໄດ້ຮັບຜົນການທົດລອງທີ່ດີທີ່ສຸດ.